Brug og forholdsregler for ultrafiltreringscentrifugerør
1) Vælg et passende ultrafiltreringsrør.Bemærk, at UF-membraner er forskellige i deres toleranceniveau over for forskellige kemikalier.Typisk kan ultrafiltreringsrør med en molekylvægtsgrænse på 10 kDa vælges med en molekylvægtsgrænse, der ikke bør være større end 1/3 af molekylvægten af proteinet af interesse, såsom 35 kDa.Hvis molekylvægten af proteinet af interesse er omkring 10 kd, kan et ultrafiltreringsrør med en molekylvægt cut-off på 3 KD anvendes.
(2) Ultrafiltreringen, nyindkøbt, er tør, med ultrarent vand tilsat før brug, og vandet passerer fuldstændigt gennem membranen, isbadet eller køleskabet forkølet i et par minutter.Herefter hældes vandet fra, altså proteinvæsken, og hvor meget der tilsættes, alt efter hvad der ikke er mere end den hvide streg i toppen af røret.Operationen er let, og ultrafiltreringsrøret skal forkøles på is, før proteinopløsningen tilsættes.
3) Både massen og tyngdepunktet skulle nå balancen.Bemærk, at rotationshastigheden og accelerationen ikke er særlig hurtig, ellers beskadiger ultrafiltreringsmembranen direkte.Centrifugal ultrafiltrering blev startet (centrifuge forkølet til 4 grader).Efter omdrejningstallet for forskellige centrifuger var blevet konverteret til g, var det anderledes.Accelerationen af centrifugen blev justeret til et minimum, hvilket reducerede trykket på membranen.Bemærk, sørg for at forlade centrifugen, efter at centrifugen har nået sin destinationshastighed, eller hvis du har et problem, kan du ikke håndtere det for første gang.Orienteringen af membranen til spindlen blev justeret i henhold til instruktionerne (vinkelcentrifugehuset er membran til akse vinkelret).Ved praktisk brug er den generelle omdrejningshastighed lavere end i vejledningen, så centrifugerørets levetid kan forlænges.
3) Både massen og tyngdepunktet skulle nå balancen.Bemærk, at rotationshastigheden og accelerationen ikke er særlig hurtig, ellers beskadiger ultrafiltreringsmembranen direkte.Centrifugal ultrafiltrering blev startet (centrifuge forkølet til 4 grader).Efter omdrejningstallet for forskellige centrifuger var blevet konverteret til g, var det anderledes.Accelerationen af centrifugen blev justeret til et minimum, hvilket reducerede trykket på membranen.Bemærk, sørg for at forlade centrifugen, efter at centrifugen har nået sin destinationshastighed, eller hvis du har et problem, kan du ikke håndtere det for første gang.Orienteringen af membranen til spindlen blev justeret i overensstemmelse med instruktionerne (vinkelcentrifugehuset er membran til akse vinkelret).Ved praktisk brug er den generelle omdrejningshastighed lavere end i vejledningen, så centrifugerørets levetid kan forlænges.
(4) Når den er koncentreret til de resterende 1 ml, tages 50 µl bufferopløsning, tilsættes 10 µl gennemstrømning og se, om der er en blå farve, som en vurdering af, om ultrafiltreringsrøret mangler protein.Hvis røret er utæt, skal du hælde det øverste lag igen og flyde igennem i et nyt rør for at starte ultrafiltrering.For at bestemme præcist, om rørene er savnet, centrifuger i 10 minutter med 5 mg BSA før gennemstrømning, kør på proteinlim eller Bradford råanalyse, og fortsæt med at tilsætte den resterende koncentrerede proteinopløsning (som fungerer på is og forhindrer proteiner i at opvarme) indtil alt koncentratet er tilsat.Vær forsigtig under centrifugering, hvis der forekommer udfældning af proteiner, hvilket fører til lukning af rør.Hvis der forekommer udfældning, skal du bestemme, om den specifikke årsag til udfældning er en for høj proteinkoncentration eller en uhensigtsmæssig buffer;Førstnævnte kan løses ved ultrafiltrering af flere ultrafiltreringsrør samtidigt, hvilket reducerer koncentrationen, og sidstnævnte ved at udveksle forskellige bufferopløsninger, indtil der ikke sker udfældning af proteinet.
(4) Når den er koncentreret til de resterende 1 ml, tages 50 µl bufferopløsning, tilsættes 10 µl gennemstrømning og se, om der er en blå farve, som en vurdering af, om ultrafiltreringsrøret mangler protein.Hvis røret er utæt, skal du hælde det øverste lag igen og flyde igennem i et nyt rør for at starte ultrafiltrering.For at bestemme præcist, om rørene er savnet, centrifuger i 10 minutter med 5 mg BSA før gennemstrømning, kør på proteinlim eller Bradford råanalyse, og fortsæt med at tilsætte den resterende koncentrerede proteinopløsning (som fungerer på is og forhindrer proteiner i at opvarme) indtil alt koncentratet er tilsat.Vær forsigtig under centrifugering, hvis der forekommer udfældning af proteiner, hvilket fører til lukning af rør.Hvis der forekommer udfældning, skal du bestemme, om den specifikke årsag til udfældning er en for høj proteinkoncentration eller en uhensigtsmæssig buffer;Førstnævnte kan løses ved ultrafiltrering af flere ultrafiltreringsrør samtidigt, hvilket reducerer koncentrationen, og sidstnævnte ved at udveksle forskellige bufferopløsninger, indtil der ikke sker udfældning af proteinet.
(5) De første par trin bruges til at koncentrere proteinet, og hvis bufferen skal udskiftes, tilsættes forsigtigt ny buffer (ultrafiltrering gennem en 0,22um ultrafiltreringsmembran) til ca. 1 ml totalt protein og genkoncentreres til ca. 1 ml i tre på hinanden følgende gange, hvor det endelige koncentrerede slutvolumen afhænger af den ønskede proteinkoncentration, generelt ikke mere end 500 µl, men også inden for 200 µl.Opnå 1000 × eller mere ved tre lejligheder, i det væsentlige lige så meget bufferændring, som beregnet ved mindst 10 × eller deromkring volumenberigelse hver gang.
(5) De første par trin bruges til at koncentrere proteinet, og hvis bufferen skal udskiftes, tilsættes forsigtigt ny buffer (ultrafiltrering gennem en 0,22um ultrafiltreringsmembran) til ca. 1 ml totalt protein og genkoncentreres til ca. 1 ml i tre på hinanden følgende gange, hvor det endelige koncentrerede slutvolumen afhænger af den ønskede proteinkoncentration, generelt ikke mere end 500 µl, men også inden for 200 µl.Opnå 1000 × eller mere ved tre lejligheder, i det væsentlige lige så meget bufferændring, som beregnet ved mindst 10 × eller deromkring volumenberigelse hver gang.
Indlægstid: 09-november 2022