PCR, er polymerasekædereaktionen, som refererer til tilføjelsen af dNTP, Mg2+, forlængelsesfaktorer og amplifikationsforstærkende faktorer til systemet under katalyse af DNA-polymerase, ved at bruge moder-DNA'et som skabelon og specifikke primere som udgangspunktet for forlængelse, Gennem trinene med denaturering, annealing, forlængelse osv. kan processen med in vitro-replikering af datterstreng-DNA, der er komplementær til stamstrengskabelon-DNA'et, hurtigt og specifikt amplificere ethvert mål-DNA in vitro.
1. Hot Start PCR
Starttidspunktet for amplifikation i konventionel PCR er ikke at sætte PCR-maskinen ind i PCR-maskinen, og så begynder programmet at amplificere.Når systemkonfigurationen er fuldført, begynder amplifikationen, hvilket kan forårsage uspecifik forstærkning, og hot-start PCR kan løse dette problem.
Hvad er hotstart PCR?Efter at reaktionssystemet er fremstillet, frigives enzymmodificeringsmidlet ved høj temperatur (sædvanligvis højere end 90°C) under det indledende opvarmningstrin af reaktionen eller "hot start"-stadiet, således at DNA-polymerasen aktiveres.Den nøjagtige aktiveringstid og temperatur afhænger af arten af DNA-polymerasen og hot-start-modifikatoren.Denne metode bruger hovedsageligt modifikatorer såsom antistoffer, affinitetsligander eller kemiske modifikatorer til at hæmme aktiviteten af DNA-polymerase.Da aktiviteten af DNA-polymerase inhiberes ved stuetemperatur, giver varmstartteknologi stor bekvemmelighed til fremstilling af flere PCR-reaktionssystemer ved stuetemperatur uden at ofre specificiteten af PCR-reaktioner.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) er en eksperimentel teknik til revers transkription fra mRNA til cDNA og bruge det som skabelon til amplifikation.Den eksperimentelle procedure er at ekstrahere totalt RNA i væv eller celler først, bruge Oligo (dT) som en primer, bruge revers transkriptase til at syntetisere cDNA og derefter bruge cDNA som en skabelon til PCR-amplifikation for at opnå målgenet eller detektere genekspression.
3. Fluorescerende kvantitativ PCR
Fluorescerende kvantitativ PCR (Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR) refererer til metoden til at tilføje fluorescerende grupper til PCR-reaktionssystemet ved at bruge akkumulering af fluorescerende signaler til at overvåge hele PCR-processen i realtid og til sidst bruge standardkurven til kvantitativt at analysere skabelonen.Almindeligt anvendte qPCR-metoder omfatter SYBR Green I og TaqMan.
4. Indlejret PCR
Nested PCR refererer til brugen af to sæt PCR-primere til to runder af PCR-amplifikation, og amplifikationsproduktet af anden runde er målgenfragmentet.
Hvis en mismatch af det første par primere (ydre primere) får et ikke-specifikt produkt til at blive amplificeret, er muligheden for, at den samme ikke-specifikke region genkendes af det andet par primere og fortsætter med at amplificere, meget lille, så amplifikation med det andet par primere, er specificiteten af PCR blevet forbedret.En fordel ved at udføre to runder PCR er, at det hjælper med at amplificere tilstrækkeligt produkt fra begrænset start-DNA.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR er en metode til at forbedre specificiteten af PCR-reaktionen ved at justere PCR-cyklusparametrene.
I touchdown PCR er annealingstemperaturen for de første par cyklusser indstillet et par grader over den maksimale annealingstemperatur (Tm) for primerne.Højere annealingstemperatur kan effektivt reducere uspecifik amplifikation, men på samme tid vil højere annealingstemperatur forværre adskillelsen af primere og målsekvenser, hvilket resulterer i reduceret PCR-udbytte.Derfor indstilles annealingstemperaturen i de første par cykler normalt til at falde med 1°C pr. cyklus for at øge indholdet af målgenet i systemet.Når udglødningstemperaturen sænkes til den optimale temperatur, opretholdes udglødningstemperaturen i de resterende cyklusser.
6. Direkte PCR
Direkte PCR refererer til amplifikation af mål-DNA direkte fra prøven uden behov for nukleinsyreisolering og oprensning.
Der er to typer direkte PCR:
direkte metode: Tag en lille mængde prøve og tilsæt den direkte til PCR Master Mix for PCR-identifikation;
krakningsmetode: efter prøvetagning af prøven, tilsæt den til lysatet, lysér for at frigive genomet, tag en lille mængde lyseret supernatant og tilsæt den til PCR Master Mix, udfør PCR-identifikation.Denne tilgang forenkler den eksperimentelle arbejdsgang, reducerer praktisk tid og undgår DNA-tab under oprensningstrin.
7. SOE PCR
Gensplejsning ved overlapsforlængelse PCR (SOE PCR) bruger primere med komplementære ender til at få PCR-produkter til at danne overlappende kæder, således at der i den efterfølgende amplifikationsreaktion, gennem forlængelsen af de overlappende kæder, forskellige kilder til A-teknik, hvor amplificerede fragmenter overlappes og splejset sammen.Denne teknologi har i øjeblikket to hovedanvendelsesretninger: konstruktion af fusionsgener;gen site-directed mutation.
8. IPCR
Invers PCR (IPCR) anvender reverse komplementære primere til at amplificere andre DNA-fragmenter end de to primere og amplificerer ukendte sekvenser på begge sider af et kendt DNA-fragment.
IPCR blev oprindeligt designet til at bestemme sekvensen af tilstødende ukendte regioner og bruges mest til at studere genpromotorsekvenser;onkogene kromosomale omlejringer, såsom genfusion, translokation og transposition;og viral genintegration, er også almindeligt anvendt nu. Til stedrettet mutagenese kopieres et plasmid med den ønskede mutation.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) er en teknik til absolut kvantificering af nukleinsyremolekyler.
Der er i øjeblikket tre metoder til kvantificering af nukleinsyremolekyler.Fotometri er baseret på absorbansen af nukleinsyremolekyler;real-time fluorescerende kvantitativ PCR (Real Time PCR) er baseret på Ct-værdien, og Ct-værdien refererer til det cyklusnummer, der svarer til den fluorescensværdi, der kan påvises;digital PCR er den seneste kvantitative teknologi baseret på enkelt-molekyle PCR metode til at tælle nukleinsyre kvantificering er en absolut kvantitativ metode.
Indlægstid: 13-jun-2023